研究紹介

Rap1シグナルによる免疫細胞動態の新展開 低分子量Ｇ蛋白質Rap１はケモカインや抗原受容体によって活性化されインテグリン接着性を亢進させる働きをしています。Rap1シグナルによってインテグリンを介する細胞接着がどのように調節され、免疫細胞の動態や抗原認識にどのような役割を果たしているのかを明らかにすること、 そしてその成果を免疫疾患の病態解明や治療戦略に応用することを目指しています。

これまでRap1－GFP結合蛋白質RAPL、蛋白質キナーゼMst1を同定し、β２インテグリン活性化やリンパ球ホーミングにおける役割を報告しました。さらに、2光子組織イメージングの改良によってリンパ節内組織移動、 胸腺細胞の移動や選択過程、制御性T細胞機能、免疫シナプスにおける役割が明らかになってきました。

また一分子イメージングの手法を確立することによってLFA-1/ICAM-1結合動態が初めて計測可能になり、Rap1シグナルによるkindlin-3調整が明らかになりました。

Rap1機能に関する業績解説はこちら。

2012年以降は以下を参照。

 

1．末梢リンパ球動態：

リンパ球は末梢リンパ節と血管内を再循環しています。二光子顕微鏡を用いた生体イメージングが開発され、リンパ節内に移動したリンパ球が非常に高速に移動している様子が観察されました。片貝講師（現新潟大学医学部教授）は、リンパ組織が間葉系ストローマ細胞（fibroblastic reticular cells,FRC)が網目のような組織を構築し、樹状細胞、リンパ球が密接に分布することに着目し、リンパ球動態との関連を二光子顕微鏡を用いて解析しました（図１・Video1)。


図１ 二光子顕微鏡によるリンパ組織イメージング HEV (高内皮細静脈）、濃い緑）、 FRC（ストローマ細胞、緑）、T細胞 （赤）

イメージング手法として従来のintravital法、explant法に加え、新たにリンパ節スライスを用いた手法（図２）を比較検討し、３つの手法でほぼ同じT細胞の活発な移動を観察できること、その動態の詳細な解析から高速で直線的に移動する細胞と低速でランダムに移動する細胞に区別されることを見出しました。この動態にLFA-1/ICAM-1やケモカインが関与するか抗体や阻害剤を用いて解析した結果、高速移動にLFA-1/ICAM-1およびGiシグナルが必要であることが判明しました（図3）。

 

図2リンパ節スライス組織を用いた二光子イメージングリンパ節を寒天に包埋後、ビブラトームで被膜をカットし、ラベリングされたリンパ球を組織に添加する。酸素で飽和した培地を潅流させながら二光子顕微鏡で観察。この方法で抗体や阻害剤を直接添加でき、効果を評価できる。

 

図3 LFA-1/ICAM-1阻害剤によるリンパ球組織移動移動の低下 上段左　LFA-1抗体添加によって移動速度の低下がおこる。 上段右　移動速度（横軸）と方向変化（縦軸）のグラフ 高速で直線成分を含む移動がLFA-1抗体によって減少 （赤点線）下段左、右。 ICAM-1欠損マウス由来リンパ節を用いた同様の解析 ICAM-1欠損によっても高速で直線的成分を含む移動 が障害。

また、T細胞はストローマ細胞、樹状細胞のどちらのICAM-1に依存しながら移動するのか明らかにするために、ICAM-1をストローマ細胞で欠損させた場合、骨髄由来細胞で欠損させた場合について比較したところ、骨髄系由来の細胞、特に樹状細胞が発現するICAM-1が必要であることが判明しました。実際、T細胞は樹状細胞に接触しながら移動している様子が組織内で観察されました（Video2)。

さらに、T細胞の組織内密度を低下させた場合、LFA-1/ICAM-1を介する高速移動が増加することもわかりました。片貝講師はストローマ細胞がCCL21とともにautotaxin（ATX)を発現していることに着目し、ATXが産生するLPAがRhoシグナルを介して低速移動を刺激していることを明らかにしました。



（video 2:樹状細胞（緑）、T細胞（赤））

Katakai T, Kinashi T, Microenvironmental Control of High-Speed Interstitial T Cell Migration in the Lymph Node. Front Immunol. 2016 May 13;7:194. doi: 10.3389/fimmu.2016.00194. eCollection 2016.
Katakai T., Kondo N., Ueda Y., and Kinashi T., Autotaxin Produced by Stromal Cells PromotesLFA-1?Independent and Rho-Dependent Interstitial T Cell Motility. 2014;J Immunol 2014;193:617-626; Prepublished online 16 June, (doi: 10.4049/jimmunol.1400565)
Katakai T, Habiro K, Kinashi T. Dendritic Cells Regulate High-Speed Interstitial T Cell Migration in the Lymph Node via LFA-1/ICAM-1. J Immunol 191(3):1188-99.　2013 DOI: 10.4049/jimmunol.1300739

 

 

２．胸腺および自己免疫疾患：

Mst1キナーゼによる胸腺細胞の移動と自己抗原認識の機構
Mst１欠損マウスはリンパ球ホーミング異常や胸腺細胞の移出異常によって末梢リンパ組織が低形成になりますが、加齢とともにリンパ球、白血球の多臓器へ浸潤（図１）、抗DNA抗体などの自己抗体産生が顕著になります。植田講師はその原因がT細胞の自己寛容形成過程の異常にあることを突き止めました。Mst1をT細胞系列で欠損させ、自己免疫病態が起こること、TCRトランスジェニックマウスモデルを用いて胸腺細胞の選択異常があることを明らかにしました。胸腺組織スライスを用いた二光子イメージングによってMst1が胸腺細胞、とくに髄質存在する成熟胸腺細胞の移動に関与していることを見出しました。一般に自己寛容は胸腺内で自己反応性胸腺細胞の除去、いわゆる負の選択が関与すると考えられています。そこでモデル自己抗原としてovalbumin(OVA)をラットのインスリンプロモーターによって発現させたトランスジェニックマウス(RIP-OVA)由来の胸腺組織とOVA特異的TCRを発現するマウス由来T細胞を共培養して負の選択過程を再現し、二光子顕微鏡で観察したところ、OT-II 胸腺細胞が胸腺上皮細胞とクラスターを形成し、その過程でCa2+の濃度が上昇している様子が観察されました（図２）。

図1　Mst1欠損マウスに発症する多臓器の炎症像
左列　Mst1 flox マウス（正常）、中央列　Mst1欠損マウス、右列　T細胞系列Mst1欠損マウス

 

図２　胸腺組織イメージング
上段　野生型胸腺組織（左）とRIP-OVA胸腺（右）における

野生型胸腺細胞（緑）、OVA特異的（OT-II）胸腺細胞（赤）のイメージング。

下段　カルシウムイメージング。OT-II胸腺細胞(Indo-PE3ラベル）の野生型胸腺（左）およびRIP-OVA胸腺におけるカルシウム応答。OT-II胸腺細胞はRIP-OVA胸腺内でクラスターを形成し（矢印）、カルシウムの上昇を示す。

免疫染色およびAire-GFP knock-inマウスを用いた解析から、Aire(autoimmune regulator)を発現している胸腺上皮細胞にOVA抗原依存的にLFA-1/ICAM-1を介して強く接着していること、Mst1欠損するとその接着過程が障害されることが判明しました（Video3)。この結果はAire陽性胸腺上皮細胞が抗原を提示していること、およびその障害が自己反応性胸腺細胞の除去の低下、自己免疫発症につながったと推察されました。



(Video3)

Ueda Y., Katagiri K., Tomiyama T., Yasuda K., Habiro K., Katakai T., Ikehara S., Matsumoto M, Kinashi T.　Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen-recognition in the thymus.　Nat. Commun. (2012) Oct 2;3:1098. doi: 10.1038/ncomms2105.

 

 

３．胸腺細胞におけるSema3E/plexinD1によるRap1活性化の負の制御：

セマフォリン クラスIIIファミリーは細胞ガイダンス分子として神経突起の伸長・反発、血管形成、骨格筋シナプス結合に重要な働きをしています。植田講師は胸腺においてSema3Eは胸腺髄質から皮質に分布し、その受容体であるplexinD1はCD69陽性胸腺細胞に発現していること、plexinD1が細胞内にsplit GAPドメインをもちRap1を不活化する可能性があることに着目し、その役割について解析しました。その結果、ケモカインやTCRによるRap1の活性化がSema3Eによって抑制され、LFA-1/ICAM-1を介した接着が低下しました。Sema3Eの抑制効は活性化型Rap1で回復しますが、活性化型Rac1/Rac2起こらず、GAPドメインの変異で消失しました。またCD69陽性胸腺細胞は成熟T細胞同様に免疫シナプスを形成し、接着面に活性化Rap1が集積しますが、Sema3E添加によってRap1活性化が顕著に低下し、安定したSMAC構造が消失していくことがわかりました。（図１、図２）

図1　Sema3eによるRap1活性化の抑制
CD69陽性OT-II胸腺細胞による免疫シナプスにおけるRap1活性化（上段）およびsema3e添加後の抑制　（数字　秒）

図2　Sema3eによる免疫シナプスの抑制
　CD69陽性OT-II胸腺細胞による免疫シナプス（上段）　および　sema3e添加後の抑制　（数字　秒）。　OVA-MHC (赤、　　cSMAC), ICAM-1 (緑、pSMAC)

さらにplexinD1をCD4-Creによって欠失させたマウスでは髄質に存在するCD4陽性胸腺細胞が増加していることがわかりました。これらの結果からSema3E/plexinD1はRap1を不活化し、胸腺細胞の髄質への移動や抗原認識に抑制的に働いていることが明らかになりました。

図３　plexinD1欠損胸腺の組織像
野生型と比較し、髄質におけるCD4胸腺細胞（赤）の密度が低下

 

 

４．Mst1欠損による制御性T細胞抑制機能の障害：

Mst1欠損によっておこる自己免疫様病態に胸腺細胞の選択の異常が関与していることがわかっていましたが、末梢性寛容に重要な役割をもつ制御性T細胞の機能については不明でした。大学院生の富山尚君と植田祥啓講師は野生型およびMst1欠損Foxp3陽性制御性T細胞（Treg)は、マウス大腸炎モデルを用いてTregの抑制異常を見出しました（図１）。in vitroの解析ではanti-CD3抗体刺激によるT細胞増殖抑制には異常はありませんでしたが、抗原特異的抑制機能が障害されていました。その原因としてMst1欠損Tregでは免疫シナプスの形成異常および樹状細胞のCD80/C86の抑制が障害されていることを見出しました。また、Tregは通常はCD4陽性T細胞と異なり、移動性の免疫シナプスを形成することを二光子顕微鏡による組織イメージングおよび人口膜上に再現した免疫シナプスで明らかにし、これらの過程にMst1の必要性があることがわかりました。

図1　Mst1欠損Treg抑制機能の障害
上図　マウス大腸炎による体重の推移。ナイーブT細胞(Tn)をRag2KOマウスに移入することによって大腸炎を発症し、体重が低下（黒）。野生型Tregを同時に移入する（青）ことによって発症を抑制し、成長による体重が増加がおこる。

Mst1欠損Tregでは発症を抑制できず、体重が低下する。

下図　上図の大腸組織像

図２　OT-IIマウス由来のナイーブT細胞(Tn, 緑)および制御性T細胞（WT Treg、赤)を等量混ぜ、OVA抗原を提示する樹状細胞と培養。野生型TregはTnとほぼ同等の接着を示すが、Mst1欠損Tregは接着が障害されている。

Tomiyama T, Ueda Y, Katakai T, Kondo N, Okazaki K, Kinashi T.　Antigen-specific suppression and immunological synapse formation by regulatory T cells require the mst1 kinase. PLoS One. 2013 Sep 9;8(9):e73874. doi: 10.1371/journal.pone.0073874

 

 

５．Rap1シグナルによるKindlin-3を介する新たな接着制御シグナル過程を解明：
T細胞と抗原提示細胞との間に形成される抗原特異的な接着を免疫シナプスといい、接着面の中心にTCR/peptid-MHC複合体が集積し、その周りをLFA-1/ICAM-1が取り囲むように分布しています。免疫シナプスはT細胞の抗原認識によるエフェクター細胞やメモリー細胞への分化に重要です。Mst1はLFA-1/ICAM-1結合を誘導することをすでに報告しましたが、免疫シナプス形成における機序については不明でした。
また、一般にLFA-1はinside-outシグナルによってICAM-1に対する親和性が低親和性から中間親和性、高親和性へと変化し、このダイナミックな調整が移動や停止に重要であると考えられています。しかし、接着過程におけるLFA-1/ICAM-1の結合動態および免疫シナプス形成との関連は不明でした。近藤助教らはRap1シグナルによるNDR1キナーゼ活性調節がkindlin-3を介する高親和性LFA-1/ICAM-1結合を誘導し、免疫シナプス形成に必須であることを明らかにしました。近藤助教らは免疫シナプスを人工膜を用いて再現し、LFA-1/ICAM-1結合動態を一分子レベルで計測する手法を初めて樹立しました（Video4）。その結果、高親和性結合による10秒以上の結合時間を保つものは１０％以下であり、cSMACと呼ばれるTCR/peptide-MHCクラスターのすぐ近傍に集中して発生していました。一方、低親和性（0.5秒以下）および中間親和性（1-3秒）（カッコ、結合時間）は、pSMAC領域に広く分布していました(図１）。


 

 

図１　免疫シナプスにおけるLFA-1/ICAM-1結合の一分子イメージング
A. IラベルされたCAM-1, OVA-peptide/MHCを発現した人工脂質二重膜と全反射顕微鏡よる一分子イメージング系。B..OVA-MHCクラスター(cSMAC)　像とICAM-1一分子追跡。10秒以上の結合（赤）と3秒以下の結合（緑）をcSMAC像に重ねる。C. ICAM-1結合時間の分布。ナイーブT細胞と活性化T細胞の結合パターンに差はない。

また、高いRap1活性化がcSMAC近傍で起こっており、Mst1,Kindlin-3が集積していることもわかりました。さらに、Rap1a/Rap1b欠損、Mat1/Mst2欠損T細胞の免疫シナプス解析からRap1シグナルによるMst1/Mst2へのシグナル伝達が高親和性結合調節していることが示唆されました（図2、図3）。

図2　Rap1b, Mst1/Mst2欠損による高親和性LFA-1/ICAM-1結合の低下と免疫シナプス形成障害　cSMAC像にICAM-110秒以上の結合（高親和性結合、赤）、3秒以下の結合（中～低親和性結合、緑）を重ねる。野生型と比較し、Rap1b欠損、Mst1/Mst2欠損で高親和性結合が低下し、免疫シナプスの形成が見られない。

図３　Rap1活性化とICAM-1高親和性結合
左　Rap1-GTPの分布（ヒートマップ） 右　高親和性結合（赤）、Rap1-GTP（緑）、
pMHCマイクロクラスター（青）

詳細な解析から、Rap1-GFP結合蛋白RAPLによって活性化したMst1/Mst2によってNDR1キナーゼが活性化し、Kindlin-3と会合してcSMAC近傍領域集積させること。およびKindlin-3による高親和性LFA-1/ICAM-1結合誘導が免疫シナプス形成に必須であることが明らかになりました（図4）。今回新たに見出されたシグナル経路の成果は接着制御によるT細胞の抗原認識の効率、エフェクター・記憶細胞への分化の調節解明につながると期待されます。

図４　Rap1活性化によってMst1/Mst2によるNDR1およびそのco-acitvator　Mob1のリン酸によるNDR1活性化が誘導され、Kindlin-3がcSMAC近傍に集積する。Kindlin-3はLFA-1細胞内領域に結合し、高親和性結合を誘導する。

Kondo N, Ueda Y,Kita T, Ozawa M, Tomiyama T, Yasuda K, Lim DS, Kinashi T. NDR1-dependent regulation of kindlin-3 controls high-affinity LFA-1 binding and immune synapse organization. Mol Cell Biol. 2017 Jan 30. pii: MCB.00424-16. doi: 10.1128/MCB.00424-16.

 

 

６．自己免疫疾患IgG4関連疾患とMst1遺伝子メチル化との関連解析：

ヒトIgG4関連疾患はIgG4の高値および自己免疫膵炎を主たる病変として唾液腺、涙腺、肺などの多臓器が障害される自己免疫疾患です。大学院生の福原貴太郎君、富山尚君、植田講師らは、Mst1欠損マウスが加齢とともに高免疫グロブリン値、多臓器にわたる自己免疫様病態をしめすことから、MST1遺伝子プロモーター領域のCpGクラスターに着目し、IgG4関連疾患患者でメチル化が増強しているか解析しました。その結果、自己免疫性膵炎のみを発症しているIgG4関連疾患および関節リュウマチ患者の白血球ではメチル化に変化はありませんでしたが、膵外病変をもつIgG4関連疾患患者ではメチル化が有意に増強していました。一方、RAPL遺伝子プロモーターに存在するCpGメチル化には変化がありませんでした。さらにIgG関連疾患患者の制御性T細胞を解析した結果、MST1の発現が低下していることが明らかになりました。これらのことからMST1遺伝子のエピジェネティック制御およびTregにおけるMST1の低下が自己免疫病態と関連していることが示唆されました。

図１　Mst1/Mst2欠損によるKindlin-3局在異常
上　野生型OT-II T細胞、下　Mst1/Mst2欠損OT-II T 細胞
右端：　3D像のside-view　LFA-1(赤）、kindlin-3 (緑）Mst1/Mst2欠損ではKindlin-3がcSMAC近傍に集積していない

図２　ヒトMST1遺伝子プロモーター領域CpGクラスター

図３　IgG4関連疾患におけるMST1遺伝子メチル化

Fukuhara T, Tomiyama T, Yasuda K, Ueda Y, Ozaki Y, Son Y, Nomura S, Uchida K, Okazaki K, Kinashi T. Hypermethylation of MST1 in IgG4-related autoimmune pancreatitis and rheumatoid arthritis.Biochem Biophys Res Commun. 2015 Aug 7;463(4):968-74. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.06.043.

 

 

７．Mst1欠損による細胞障害性T細胞の機能亢進と抗腫瘍免疫の増強：

Mst1欠損マウスは加齢とともに自己免疫様病態を引き起こします。大学院生の安田鐘樹君、植田講師らはMst1欠損マウスを用いて細胞障害性T細胞（CTL)の分化・成熟への影響を調べた結果、interferon-γおよびgranzymeBの発現が亢進し、in vitro CTL活性が増加していることを見出しました。解析の結果、Mst1欠損CD8陽性T細胞および分化したCTLではFoxO1,FoxO3aの発現が低下し、interferon-γおよびgranzymeBの発現を調節するT-betの発現増加が認められた。このことからMst1欠損によるFoxo1/3低下によってT-bet抑制が解除され、interferon-γ、granzymeBの発現、CTL活性の亢進に至ったと考えられました。さらにMst1欠損CTLはマウスに移植された腫瘍に対数る抗腫瘍活性が亢進し、生存期間が亢進することが確認されました。このことからMst1をターゲットにした腫瘍免疫増強の可能性が示唆されました。

図1　Mst1欠損細胞障害性T細胞 （Ｔｃ）の抗腫瘍効果の増強
左　Tc移入後の腫瘍サイズの推移、　右　生存曲線
OVA発現腫瘍細胞(EG.7-OVA)を皮下移植後、腫瘍サイズを計測、10日後、野生型およびMst1欠損Tc (5 x 105 cells)　を静注

図2　Mst1による細胞障害性機能の調節
Mst1はFoxo1/3aをリン酸化によって活性化し、T-betの発現を抑制、その結果、INF-g, granzymeの発現が低下する。Mst1欠損によってT-bet抑制が障害され、細胞障害性が増強

Yasuda K., Ueda Y., Ozawa M., Matsuda T., Kinashi T., Enhanced cytotoxic T cell function and inhibition of tumor progression by Mst1 deficiency. FEBS Letter 590(1):68-75. (2016) doi: 10.1002/1873-3468.12045.