○法医学試料中DNAの性状
犯罪捜査でDNA鑑定に用いられる血痕等は、現場に放置されて汚染や分解が生じており、しばしばポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法によるDNA解析が阻害される。そこで汚染物質が血中のヘモグロビンなどから誘導されることを見出し、限外ろ過、DNA精製基質、過酸化水素の添加などによる精製法を検討・開発してきた。DNAが分解している場合も、残存する高分子量DNAをゲルろ過法で回収することにより解析が可能となった。
- 関連論文業績
- Akane A et al. Purification of forensic specimens for the polymerase chain reaction (PCR) analysis. J Forensic Sci 38: 691-701, 1993.
- Akane A et al. Purification of highly degraded DNA by gel filtration for PCR. BioTechniques 16: 235-238, 1994.
- Akane A et al. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification. J Forensic Sci 39: 362-372, 1994.
- Akane A. Hydrogen peroxide decomposes the heme compound in forensic specimens and improves the efficiency of PCR. BioTechniques 21: 392-394, 1996.
- Akane A. PCR inhibitor in bloodstain extracts. Advances in Legal Medicine 3, pp.308-312, Yoyodo, Osaka, 1997.
- Akane A et al. Apoptosis induced by heating: Relation between DNA fragmentation and heating temperature. Advances in Legal Medicine 3, pp.554-558, Yoyodo, Osaka, 1997.
○血液型遺伝子の解析
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血痕や毛髪の血液型は凝集素解離試験などの血清学的方法で判定しているが、解析できる血液型がABO式血液型に限定される。 そこでDNAレベルでの血液型の解析法について検討し、ABO式血液型では１回のPCR反応でＯ型遺伝子をOAとOGに、MN式血液型ではM型遺伝子をMGとMTに分類する方法を開発した (図１)。 Se式血液型 (分泌型) についても同様に日本人に代表的な分泌型と非分泌型の簡便かつ確実な検出法を確立している。 このように従来から知られている血液型をDNA解析により細かく分類し、個人識別や親子鑑定などの精度を向上させている。 |
| 図１．１本鎖DNA高次構造多型 (SSCP) 分析法によるABO式およびMN式血液型遺伝子の電気泳動像 ABO: 1, A/A; 2, B/B; 3, OA/OA; 4, OG/OG; 5, B/OG; 6, B/B MN: 1, MG/MG; 2, MG/N; 3, N/N; 4, MT/N; 5, MT/MT; 6, MG/MT |
- 関連論文業績
- Akane A et al. ABO genotyping following a single PCR amplification. J Forensic Sci 41: 272-274, 1996.
- Akane A et al. ABO genotyping following a single PCR amplification. Advances in Research on DNA Polymorphisms. pp.340-343, Toyo shoten, Tokyo, 1997.
- Akane A et al. PCR-based genotyping of MNSs blood group: Subtyping of M allele to MG and MT. Jpn J Human Genet 42: 489-498, 1997.
- Li ZX et al. Allele-specific, inverse-PCR amplification for genotyping MN blood group. BioTechniques 25: 328-362, 1998.
- Watabiki T et al. ABO phenotyping by absorption-elution test using cerebral dura maters. 6th Indo Pacific Congress on Legal Medicine and Forensic Sciences, INPALMS-1998-KOBE, pp.599-602, Yoyodo, Osaka, 1999.
- Akane A et al. DNA analysis of MN blood group: Subtyping of M allele to MG and MT, and detection of duplicated allele. 6th Indo Pacific Congress on Legal Medicine and Forensic Sciences, INPALMS-1998-KOBE, pp.615-617, Yoyodo, Osaka, 1999.
- Kobayashi T et al. Effects of solvent displacement on sensitivity and specificity of monoclonal antibodies for ABO blood grouping of forensic specimens with an absorption-elution test. Legal Med 1: 68-75, 1999.
- Kobayashi T and Akane A. ABO genotyping by inverse PCR technique. Legal Med 2: 15-20, 2000.
- Li ZX et al. Allele-specific, inverse-PCR amplification for genotyping MN blood group. Polymorphism Detection and Analysis, pp.193-197, Eaton Publishing, Natick, 2000.
- Akane A and Kobayashi T. Update to: allele-specific, inverse-PCR amplification for genotyping MN blood group. Polymorphism Detection and Analysis, pp.198-199, Eaton Publishing, Natick, 2000.
- Akane A et al. Classification of standard alleles of the MN blood group system. Vox Sang 79: 183-187, 2000.
- Mitani T et al. A case of DNA analysis of ABO blood group variant allele A2. Legal Med 2: 197-201, 2000.
- Mizukami H et al. Molecular evolution of alleles of the glycophorin A gene. Legal Med 4: 13-20, 2002.
- Mitani T et al. Se genotyping following allele-specific polymerase chain reaction amplification. Legal Med 4: 193-196, 2002.
- Mitani T et al. Mung bean nuclease treatment improves Se genotyping by allele-specific inverse polymerase chain reaction amplification. Legal Med 5: 233-237, 2003.
- Watabiki T et al. ABO and Rh phenotyping by absorption-elution technique using cerebral dura maters. Legal Med 5: S187-S190, 2003.
- Mitani T and Akane A. Detection of single nucleotide polymorphism in the FUT2 gene by temperature gradient gel electrophoresis. Legal Med 7: 217-221, 2005.
- Mizukami H et al. Systematic classification of alleles of the glycophorin A (MN blood group) gene. J Human Genet 50: 667-670, 2005.
○DNA解析による性別判定法の検討
中堀豊教授が発見したアメロゲニン遺伝子はXとY染色体の両方に存在するが、両者のイントロン領域の長さが異なり、１回のPCRで確実な性別判定ができる。この遺伝子解析を法医学資料の性別判定に応用してきた。現在はSTR（Short Tandem Repeat: Microsatellite多型）の検査キットにも導入され、国際的に法科学分析の対象遺伝子の１つとなっている。
- 関連論文業績
- Akane A et al. Sex identification of forensic species by polymerase chain reaction (PCR): Two alternative methods. Forensic Sci Int 49: 81-88, 1991.
- Akane A et al. Sex determination of forensic samples by dual PCR amplification of an X-Y homologous gene. Forensic Sci Int 52: 143-148, 1992.
- Nakagome Y et al. A Y-associated allele may be characteristic of certain ethnic groups in Asia. Ann Human Genet 56: 311-314, 1992.
- Akane A et al. Purification of highly degraded DNA by gel filtration for PCR. BioTechniques 16: 235-238, 1994.
- Akane A. Hydrogen peroxide decomposes the heme compound in forensic specimens and improves the efficiency of PCR. BioTechniques 21: 392-394, 1996.
- Akane A. Sex determination by PCR analysis of the X-Y amelogenin gene. Methods in Molecular Biology, Vol.98: Forensic DNA Profiling Protocols. pp.245-249, Humana Press, Totowa, 1998.
○DNA鑑定、親子鑑定に関する総説 (日本語文献のみ)
- 赤根 敦. 親子鑑定と双子の診断. 生物の科学 遺伝, 1996年8月号.
- 赤根 敦. DNAの個人差とその応用−犯罪捜査・親子鑑定−. 生物の科学 遺伝, 2000年10月号.
- 赤根 敦. DNA鑑定. からだの科学, 2001年216号.
- 赤根 敦. 親子鑑別. 臨床のための法医学 [第４版], 朝倉書店, 2001年.
- 赤根 敦. ニコライ二世の遺骨をめぐるDNA鑑定のゆくえ. 生物の科学 遺伝, 2002年3月号.
- 赤根 敦. 遺伝形質 (血液型). 臨床のための法医学 [第５版], 朝倉書店, 2005年.
- 赤根 敦. DNA多型. 臨床のための法医学 [第５版], 朝倉書店, 2005年.
- 赤根 敦. 親子鑑定. 臨床のための法医学 [第５版], 朝倉書店, 2005年.
- 赤根 敦. 総説. 法医学領域の遺伝子検査法の変遷. 臨床検査, 2006年1月号.
- 赤根 敦. 法医学試料の問題点と抽出・精製法. 臨床検査, 2006年2月号.
- 赤根 敦. 遺伝子検査による性別判定. 臨床検査, 2006年8月号.
- 湯浅 勲ほか. 遺伝子検査による親子鑑定. 臨床検査, 2006年10月号.
- DNA多型 Vol.16, 東洋書店, 2008 (編集).
- 赤根 敦. DNA鑑定は万能か−その可能性と限界に迫る. DOJIN選書31, 2010.
- 赤根 敦. 解説−日本のDNA鑑定. DNAと犯罪捜査−各国の現状とデータベースの発展. 文庫クセジュ957, 2011.
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中毒患者の血液、尿、胃内容中から原因薬毒物を正確かつ迅速に同定することは、法医学的立場のみならず救急医療現場などでも治療方針を決める上で必要不可欠である。 そこで種々の薬毒物について、簡便迅速性を追及した検出法の開発を試みている。 正確な同定が求められる薬毒物では、血液、尿、胃内容などの生体試料から有機溶媒で粗抽出するだけで直接サーモスプレイ質量分析計に導入する分析法について検討し、さらにコンピューター制御の半自動固相抽出装置やカラムスイッチング法を応用した分離カラムを接続して、分析の簡便性と精度の向上を図っている。 現在は薬毒物の抽出・精製法について研究し、従来使用されてきた揮発性の疎水性有機溶媒の代わりに親水性有機溶媒を用い、低温処理あるいは塩処理で分離・回収する環境により優しい新技術について検討を進めている。 図２．直接導入法による胃内容中dihydrocodeine (DHC) の分析例 (サーモスプレイ質量分析計マススペクトル、左図) およびカラムスイッチング法による尿中benzodiazepine系薬物の分析例 (右図) |
- 関連論文業績
- Yoshida M et al. Forensic Sci Int 52: 13-20, 1991.
- Yoshida M et al. J Chromatogr 628: 235-239, 1993.
- Yoshida M et al. Analysis of organic compounds in a case of suicide by ignition with lacquer thinner. Jpn J Legal Med 49: 472-477, 1995.
- Yoshida M et al. Automatic extraction-analysis system for benzodiazepines in biological materials by column-switching HPLC. Advances in Legal Medicine 3, pp.532-534, Yoyodo, Osaka, 1997.
- Yoshida M et al. Determination of benzodiazepines, triazolam, nimetazepam, lormetazepam and flurazepam by thermospray liquid chromatography-mass spectrometry. Res Pract Forensic Med 40: 103-107, 1997.
- Yoshida M et al. Rapid determination of dihydrocodeine by thermospray mass spectrometry. J Chromatogr B 718: 55-60, 1998.
- Yoshida M et al. Analysis of benzodiazepines by column switching method using thermospray liquid chromatograph-mass spectrometer and photodiode array detector. 6th Indo Pacific Congress on Legal Medicine and Forensic Sciences, INPALMS-1998-KOBE, pp.774-777, Yoyodo, Osaka, 1999.
- Yoshida M and Akane A. Subzero-temperature liquid-liquid extraction of benzodiazepines for high-performance liquid chromatography. Anal Chem 71: 1918-1921, 1999.
- Yoshida M et al. Extraction of thiamylal in serum using hydrophilic acetonitrile with subzero-temperature and salting-out methods. Anal Chem 76: 4672-4675, 2004.
- Yoshida M et al. Simple colorimetric semiquantitation of hippuric acid in urine for determination of toluene abuse. Legal Med 7: 198-200, 2005.
- Yoshida M et al. Triage test and HPLC assay for analysis of vegetamin, an antipsychotic agent, using gastric contents and blood specimens. Legal Med 8: 172-176, 2006.
○法医中毒学に関する総説 (日本語文献のみ)
- 赤根 敦. 中毒死体の見方. 死体検案ハンドブック, 2005年.
- 赤根 敦. 中毒死体の見方. 死体検案ハンドブック 改訂２版, 2009年.
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平成９年度より臓器移植法が施行され脳死者からの臓器移植が開始したが、本教室では以前から脳死状態における脳幹機能の有無を調べるため、鼻腔から電極を挿入して測定する鼻腔誘導脳波について、本学脳神経外科学教室と共同で解析を進めている。 「脳死」とは意思を司る高次中枢 (大脳皮質) のみならず、呼吸・心拍等の生命維持に不可欠な自律機能の中枢である脳幹を含めた全脳死をさす。 通常は脳幹反射の消失や頭皮から誘導した脳波の平坦化で判定しているが、鼻腔誘導法では脳幹に極めて近い位置から脳波を導出できる。 この方法で脳死と診断された患者２０人のうち６人から図４に示すような徐波が導出され、完全な脳死ではない可能性が示唆された。 この事実は脳死者からの臓器移植を即否定するものではないが、脳死の定義が全脳死である以上、脳死の病態についてさらに詳細な解析が必要であろう。 |
| 図３．ある脳死者における鼻腔誘導脳波 (NR) と通常の脳波 (C3〜T4) |
- 関連論文業績
- Okii Y et al. Jpn J Legal Med 46: 7-13, 1992.
- Okii Y et al. Analysis and classification of nasopharyngeal electroencephalogram in "brain death" patients. Jpn J Legal Med 50: 57-62, 1996.
- Okii Y et al. Application of nasopharyngeal EEG in judgment of brain death. Neurosurg Emergen 1: 17-20, 1996.
- Okii Y et al. Nasopharyngeal electroencephalograms of clinically-judged "brain death" patients. Advances in Legal Medicine 3, pp.362-364, Yoyodo, Osaka, 1997.
- Okii Y et al. Study of nasopharyngeal electroencephalograms in brain death. 6th Indo Pacific Congress on Legal Medicine and Forensic Sciences, INPALMS-1998-KOBE, pp.498-500, Yoyodo, Osaka, 1999.