薬理学講座

《研究概要》

　本教室では、生理活性物質およびこれに関連する薬物の作用機構解明を中心テーマとして、主に中枢神経系、循環器系、内分泌系疾患と関連させて研究を行なっている。

1. Cl^- イオン輸送機構とその制御
　　1) Cl^- -ATPase の構造解析：Cl^- イオンは、中枢神経の過分極性抑制性シナプス伝達において中心的な役割を果たしている。また、抗てんかん薬や鎮静薬は主に、このイオンの細胞内流入を促進することにより神経細胞の興奮性を抑制する。従って、神経細胞内 Cl^- イオン濃度が低く保たれていることが、抑制性シナプス伝達やこれら薬物の効果発現に必要とされる。我々は、この Cl^- イオン濃度維持に関与する可能性のある分子として、ATP 依存性 Cl^- イオン排出を担う分子、 Cl^- -ATPase を主に脳および腎臓に見いだし、精製、構造決定を行なっている。 Cl^- -ATPaseの機能体蛋白質は、主要構成ユニット 62, 60, 55, 51 kDa 蛋白質を含む 520 kDa または 580 kDa の複合体蛋白質として精製され、51 Da 蛋白質が触媒ユニットであると考えられた。他のユニットの 55 kDa 糖蛋白質を精製し、その部分アミノ酸配列を基にラット脳 cDNA ライブラリーからcDNAクローンを得た。本蛋白質は、504 個のアミノ酸から成り、28 個のシグナルペプチド領域、複数のミリストイル化部位などを含む新しい蛋白質であった。この cDNA 配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成し、培養海馬神経細胞に導入したところ、55 kDa 蛋白質生成を抑制すると共に細胞内 Cl^- 濃度を増加させた。免疫組織化学法および免疫電子顕微鏡による解析により、55 kDa 蛋白質は主に神経細胞の細胞膜に局在することが確かめられた。これらの結果から、 55 kDa 蛋白質は Cl^- -ATPase 活性を担うユニットである可能性が示された。

　 2) Cl^- -ATPase 活性の制御：再構成脂質膜における脳の Cl^- -ATPase は、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸（PI4P）の存在により高い活性を示した。アルツハイマー病患者の脳において PI4 キナーゼ活性が減少しているという報告に着眼し、この疾患の神経毒性変化に関与するとされるアミロイドβ（Aβ）蛋白質による Cl^- -ATPase の活性制御と PI 代謝との関連について検討した。Aβまたはその活性部位ペプチドは、用量依存的にCl^- -ATPase の活性を抑制（Aβ25-35>Aβ1-42>Aβ1-40）し、この抑制は 8-Br-cyclic GMP またはイノシトールの同時添加により消失した。更にこの活性の回復は、 PI4 キナーゼの阻害剤の添加により減少した。また、Aβ処置後の細胞膜分画では、PI、PIP、 PIP2 が減少しており、細胞は低濃度のグルタミン酸毒性に対する感受性の増加を示した。これらの結果から、Aβ蛋白質は PI 代謝特に PI4P レベルの低下を介して Cl^- -ATPase 活性を抑制し、神経細胞の前アポトーシス状態の形成に関与している可能性が示唆された。

　　3)アンモニア処置後の神経細胞内 Cl^-上昇の GABAc 受容体刺激を介した抑制：高アンモニア血症は中枢神経細胞内 Cl^- 濃度を変化させ過分極性抑制性シナプス伝達を変化させる可能性がある。培養海馬神経細胞に臨床上起り得る濃度のNH4Clを 2 日間作用させると細胞内 Cl^- 濃度が上昇する。マウスにおいて強力な抗不安作用薬を示す dihydrohonokiol-B を同時に作用させると細胞内 Cl^- 濃度は正常レベルに復した。この作用はGABAc 受容体作動薬 cis-4-aminocrotonic acid の同時添加によっても見られGABAc 受容体阻害薬により消失することからGABAc 受容体刺激を介していると考えられた。

　　4) 虚血／再潅流後の心筋細胞内 pH および［Ca^2＋］ i の変化における Cl^- /HCO3^- 交換輸送体の関与：虚血（低酸素化）により心筋細胞内 pH は酸性側に傾き、次いで再潅流（再酸素化）により中性域へと回復する際にCa^2＋過剰負荷が生じるが、この現象は心血管系手術後の心筋障害の原因として重要である。単離心室筋細胞を用いた蛍光顕微測光装置による解析から、低酸素化時の細胞内 pH の低下にはCl-/HCO3- 交換輸送体の活性亢進が関与すること、その活性亢進の少なくとも一部にはプロティンキナーゼ C の活性化が関わっていることが明らかになった。また、再潅流（再酸素化）時に見られるCa^2＋過剰負荷やラット心室乳頭筋の収縮力低下もCl^-/HCO3^- 交換輸送体の阻害薬により緩和されることから、これら現象にも Cl^- /HCO3^- 交換輸送体の活性亢進が関与していることが証明された。

2. 生理活性物質に対する細胞内情報伝達機構
　　1) ラット心室乳頭筋細胞におけるα１アドレナリン受容体作動薬の変力効果に関与する受容体サブタイプおよび G 蛋白質：α１アドレナリン受容体作動薬は、ラット心室乳頭筋細胞において3 相性（一過性陽性→一過性陰性→持続性陽性）変力効果を示す。この第 2 および 3 相の変力効果に関与する受容体サブタイプおよび細胞内シグナリングを比較した。α１A 受容体の拮抗薬は第３相の持続性陽性変力効果を、α１B 受容拮抗薬は第２相の一過性陰性変力効果を、それぞれ選択的に阻害した。また、百日咳トキシン（ IAP）による前処置により第２相のみが選択的に抑制された。更に第２相はウアバインによっても阻害された。これらの結果より、第 2 相はα１B 受容体／ GqおよびNa⁺, K⁺ATPase活性化を、第３相はα１A受容体／ Gi を介するシグナリング経路をとることが示された。

　　2)プロテアーゼ活性化受容体 2（PAR2）刺激による気道上皮細胞内シグナリングの解析：プロテアーゼ活性化受容体（protease activated receptor: PAR）は、その細胞外特定領域がトリプシンやトロンビンなどのセリンプロテアーゼによって限定分解を受けることにより活性化される G 蛋白質共役型受容体である。モルモット培養気道上皮細胞にPAR1 および PAR2 刺激作用をもつトリプシンを作用させると[Ca^2＋] i は一過性に増加した。この反応は PAR1 刺激作用をもつトロンビンでは認められなかったことから、 PAR2 刺激によるものと考えられた。このPAR2 刺激による [Ca^2＋] i の上昇はPLCβ阻害薬やCa^2＋-ATPase 阻害薬の処置後には認められなかったことより、細胞内貯蔵 Ca^2＋の動員によるものと考えられた。

3. ホルモンやホルモン受容体分子発現と機能
　　ヒトリンパ球および白血球が発現する成長ホルモンとその受容体、成長ホルモン分泌促進因子受容体とその内因性 ligand (Ghrelin) の発現に関する解析：成長ホルモンは免疫応答において重要な役割を果たしていると考えられている。成長ホルモンの mRNA および蛋白質レベルにおける発現は、３種類のヒト白血病細胞株すなわち、T cell 系、 B cell 系および Myeloid 系細胞株のうち主にB cell 系細胞株に認められた。また、この mRNA は、健常ヒト血球細胞においても、主に B cell に検出された。成長ホルモン受容体の mRNA の発現は、すべての白血病細胞株において認められたが、健常ヒト血球細胞の解析では主に B cell に発現していることが認められた。健常ヒト B cell における成長ホルモンおよび成長ホルモン受容体の mRNAの発現レベルは個体間で異なっていたが、両発現レベルの間に正の相関が見られた。健常ヒト B cell を用いた単一細胞 RT-PCR により、成長ホルモンおよびその受容体の mRNAのうち両方を発現している細胞と成長ホルモンのみを発現している細胞が認められた。成長ホルモン分泌促進因子受容体とその内因性 ligand (Ghrelin) の発現はいずれの白血病細胞株系およびいずれの健常個体からの B cell においても認められた。これらの結果から、成長ホルモンは主に B cell から分泌されて局所で作用すること、成長ホルモン分泌促進因子受容体とその内因性 ligand (Ghrelin) はホルモン分泌促進作用以外の作用を持つ可能性が示された。

《研究業績》

原　　著

Kawasaki H, Otani H, Mishima K, Imamura H and Inagaki C (2001)
Involvement of anion exchange in the hypoxia/reoxygenation-induced changes in pHi and [Ca^2＋]i in cardiac myocyte.
Eur J Pharmacol 411: 35-43

Inagaki C, Hattori N., Kitagawa , Zeng X-T and Yagyu K (2001)
Cl^--ATPase in rat brain and kidney.
J Exp Zool 289: 224-231

Zeng X-T, Mikami-Uriu T, Higashida T, Yagyu K, Kitagawa K, Hattori N, Otani H, Omori K and Inagaki C (2001)
Developmental changes in Cl^--ATPase activity in rat brains.
Neurosci Lett 302: 101-104

Otani H, Oshiro A, Yagi M and Inagaki C (2001)
Pertussis toxin-sensitive and -insensitive mechanisms of α1-adrenoceptor- mediated inotropic responses in rat heart.
Eur J Pharmacol 419: 249-252

Hattori N, Saito T, Yagyu T, Jiang B-H, Kiatagawa K and Inagaki C (2001)
GH, GH receptor, GH secretagogue receptor, and ghrelin expression in human T cells, B cells, and neutrophils.
J Clin Endocr Metab 86: 4284-4291

Yagyu K, Kitagawa K, Irie T, Zeng X-T, Hattori N and Inagaki C (2001)
Amyoid β proteins inhibit Cl^--ATPase activity in cultured rat hippocampal neurons.
J Neurochem 78: 569-576

Mishima K, Otani H, Tanabe T, Kawasaki H, Oshiro A, Saito N, Ogawa R and Inagaki C (2001)
Molecular mechanisms for α2-adrenoceptor-mediated regulation of synoviocyte populations.
Jpn J Pharmacol 85: 214-226

Irie T, Miyamoto E, Kitagawa K, Maruyama, Y, Inoue K and Inagaki C (2001)
An anxiolytic agent, dihydrohonokiol-B, inhibits ammonia-induced increases in the intracellular Cl^- of cultured hippocampal neurons via GABAc receptors.
Neurosci Lett 312: 121-123

Kitagawa K, Yagyu K, Yamamoto A, Hattori N, Omori K, Zeng X-T and Inagaki C (2001)
Molecular cloning and characterixation of the Cl^- pump-associated 55-kDa protein in rat brain.
Biochem Biophys Res Commun 289: 363-371

学会発表

稲垣千代子（ 2001）
Cl-輸送系研究の現状と創薬（シンポジウム）
第74回日本薬理学会年会、横浜

北川香織、稲垣千代子（ 2001）
Cl-能動輸送とアミロイドβ蛋白毒性（シンポジウム）
第24回日本神経科学・第44回日本神経化学合同大会（Neuro2001）、京都

姜宝紅、服部尚樹、劉氷、北川香織、稲垣千代子（2001）
ヒト免疫細胞におけるクロライドチャネル（CLC-2,3,4,5）の発現について
第74回日本薬理学会年会、横浜

大谷ひとみ、大城明寛、矢木泰弘、入江貴雄、斉藤尚亮、稲垣千代子 (2001)
アンモニアによるプロテインキナーゼＣαおよびβⅡアイソフォームの活性化
第74回日本薬理学会年会、横浜

大城明寛、大谷ひとみ、矢木泰弘、稲垣千代子 (2001)
プロテアーゼ活性化型受容体-2 (PAR-2) 刺激による気道上皮細胞内 Ca2+ 上昇機構
第74回日本薬理学会年会、横浜

服部尚樹、姜宝紅、劉氷、北川香織、稲垣千代子（2001）
ヒト免疫細胞における成長ホルモンおよび成長ホルモン受容体発現について
第74回日本薬理学会年会、横浜

曹訓庭、柳生恭子、北川香織、服部尚樹、稲垣千代子（2001）
ラット脳における発育期の Cl^--ATPase
第74回日本薬理学会年会、横浜

北川香織、柳生恭子、服部尚樹、曹訓庭、稲垣千代子（2001）
ラット脳における Cl-ポンプサブユニット55kDa 蛋白質の細胞内局在
第74回日本薬理学会年会、横浜

鈴川純子、大森京子、稲垣千代子 (2001)
マウス脳室内への c-fos アンチセンスの投与はエタクリン酸誘発痙攣により生じる痙攣準備性の成立を抑制する
第74回日本薬理学会年会、横浜

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