医化学講座

医　化　学　講　座

《研究概要》
１）痛みの伝達機構
　本来痛みを誘発しない触覚刺激がどの様な神経回路や生体因子を介して痛み（アロディニア）を誘発するのか、痛覚過敏反応に比して、その発現機序は未だに不明な点が多い。痛覚の伝達が一次求心性線維の入力、脊髄後角の神経細胞、層構造でどのように制御されているのか、なぜ触覚が痛覚として誤認されるのかという重要かつ基本的な問題を神経の可塑性に焦点をあてて研究を進めている。当教室においてノックアウト(KO)マウスを用いた行動薬理実験から、プロスタグランジン (PG) 、オピオイド（ノシセプチン（Noc/OFQ）、ノシスタチン（NST））、グルタミン酸や一酸化窒素 (NO) がアロディニアに関与することを明らかにしてきた。今年度は、アロディニアに関与する新規遺伝子のクローニング、遺伝子の発現変化に伴う痛みの発生機構、脊髄スライスを用いた神経回路網の空間的、時間的イメージング、発光蛋白質間でエネルギー移動（BRET、Bioluminescence Resonance Energy Transfer )を利用したNoc/OFQとNSTの産生調節機構に関する研究を行った。

i)　アロディニアに関与する特異的遺伝子の単離
　我々はPGF2αによるアロディニアがカプサイシン非感受性のAβ線維を介するのに対し、PGE2によるアロディニアはカプサイシン感受性のC線維を介することから、アロディニアの２つの異なる反応経路、発症機構があることを明らかにした。 PGF2αによるアロディニアはモルヒネの鎮痛効果がみられないことから、この発症機構を明らかにすることは非常に重要である。PGF2αによるアロディニアを特異的に消失させる処置方法を見いだし、処置群と未処置群の脊髄から調製したcDNA間のサブトラクションにより15種類の既知の遺伝子と14種類の未知の遺伝子を同定した。個々の遺伝子の塩基配列全長の単離と脊髄での　mRNAの発現の確認を行った。これら遺伝子のアンチセンスオリゴを合成して留置カテーテルで1週間に渡り脊髄に投与した。いくつかのアンチセンスオリゴはPGF2αによるアロディニアを抑制した。これらの遺伝子の機能解析をさらに進めている。

ii)　神経ペプチドNoc/OFQとNSTによる痛覚制御の分子メカニズム
Noc/OFQの前駆体蛋白上に、Noc/OFQによる痛覚反応を抑制する生理活性ペプチドを発見し、ノシスタチン (NST)と名づけた。NSTとNoc/OFQは、脊髄後角においてはともに表層に存在し、各々の受容体を介してその作用を発揮することを明らかにしてきた。NSTとNoc/OFQによる痛覚制御機構を明らかにするため、NST受容体の単離同定とペプチドの産生遊離機構の解明を軸に研究を進めた。

a)　NST受容体の同定
　¹²⁵I標識NST誘導体を合成し、マウス脊髄膜画分でフォトアフィニティラベリングを行った結果、約33 kDaの結合蛋白が特異的に標識された。この蛋白は、細胞膜のラフト画分に存在し、GTPγSの処理により消失したことから、GTP結合膜蛋白の可能性が示唆された。現在、この蛋白の精製、同定及び遺伝子のクローニングを試みている。
b)　ペプチドの産生遊離機構
　ペプチドの産生、遊離機構および、産生調節を担うと考えられるペプチドのプロセッシングに関与する蛋白分解酵素の解明を目的とし、生物発光蛋白の導入さらに、その蛋白間のエネルギー移動を応用した方法(BRET)の確立を試みた。(発光酵素)−(NST・Noc/OFQ)−(GFP)の融合蛋白の遺伝子ベクターを構築し、細胞に導入した。この融合蛋白は、NST・Noc/OFQペプチドがプロセッシングされない場合は発光酵素の光はエネルギー移動により、GFPを励起し緑色の発光となることを、NST・Noc/OFQペプチドがプロセッシングされた場合は、発光酵素自体の青色光を発することを認めたことより、ペプチドのプロセッシングをモニターできるプローブが確立できた。さらに、発色光を指標にペプチドの分解過程を追跡し、プロセッシング酵素のクローニング、微弱発光解析顕微鏡装置により発光を追跡、プロセッシング過程のリアルタイム解析を試みている。

iii)　侵害性刺激による遺伝子発現誘導と痛覚過敏反応
　PGI2（プロスタサイクリン）受容体（IP）KOマウスではカラゲニンによる炎症反応や酢酸ライジング試験で痛覚行動が抑制されるのに対し、ホットプレート試験やtail-flick試験で熱刺激に対する反応に変化がなかったことから、PGI2は末梢で痛覚反応に関与することが示唆されていた。足蹠にカラゲニンを注射して１時間からCOX-2のｍRNAとともに、IP受容体ｍRNAの発現が増加した。６時間後にIP受容体作動薬を髄腔内に注入すると処置側、未処置側ともに痛覚過敏反応が生じた。末梢部位の炎症に伴って、これまで発現していなかったIP受容体が誘導され、産生が増加したPGI2がIP受容体を活性化して中枢性に痛覚伝達に関与する結果は、侵害性刺激の持続により誘導される生体因子の関与はKOマウスでは見落とされる可能性を示唆するものである。

iv)　アロディニアに関する神経回路網の空間的および時間的イメージング
　痛みの動物モデルより得たアロディニアの行動薬理学的結果を基に、ビデオマイクロスコピーによるイメージング法を用いてアロディニア誘導に関与する神経回路の二次元的可視化を試みている。その回路におけるPGや痛覚に関連する神経ペプチド類の作用機構のイメージングを光学的膜電位、細胞内カルシウムイオン濃度（[Ca²⁺]i）、NOについて単独あるいは同時に二重染色して遂行し、行動薬理学的結果と比較検討している。例を挙げると、PGF受容体 (FP) KOマウスの脊髄スライス標本における[Ca²⁺] i 動態をイメージしたところ、脊髄後角のIV層附近で、オピオイド受容体の各種アゴニストU50488H (κ受容体)、DPDPE（δ受容体）、DAMGO（μ受容体）が[Ca²⁺] i 上昇を引き起こし、U50488Hが最も大きな[Ca²⁺] i 上昇を引き起こすことを見いだした。L5結紮モデルで痛覚過敏反応を引き起こす個体を用いて脊髄におけるNO産生をNOプローブ試薬のDAF-FMを用いてイメージングしたところ、結紮した側のNO上昇が反体側よりも大きい傾向にあることを観察した。グルタミン酸誘導体では[Ca²⁺] i 動態とNO動態に解離が見いだされた。このように、脊髄スライスを用いるイメージング実験は、痛覚の神経回路網を解析する手段として期待される。

２）肝機能調節因子としてのサイトカインの役割
　病態時の肝臓では、炎症性サイトカインによる様々な遺伝子の発現誘導がその機能不全と深く関連している。インターロイキン1β (IL-1β) などにより誘導される誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）は多量のNOを産生する。NOは肝障害そのものを引き起こしさらに悪化させる作用と逆にその障害を減弱化する相反する２つの作用をもつ。しかしながら転写因子NF-κBを介したiNOS誘導の制御メカニズムの詳細は不明な点が多い。今年度は動物モデル、初代培養肝細胞と小腸株細胞を用いて、iNOS/NO誘導の作用機構を明らかにした。

i)　肝糖代謝とNO産生誘導との関係
肝癌などの手術において、肝部分切除後の感染、炎症により肝機能不全が起こる。NOは肝機能低下に関与していると報告されているが不明な点が多い。NO にはiNOS以外に構成型NOS (cNOS)があり、選択的NOS阻害薬がない現状では、肝機能にどのNOSが関与するのか結論づけることは難しい。今年度、野性型マウスとiNOS-KO マウスから初代培養肝細胞を調製し、LPSとIL-1β、TNFα、INFγのサイトカイン混合液 (CM) で誘導されるiNOS誘導とエネルギー代謝との関係を検討した。iNOSにより産生される NOは肝細胞のATPレベルやケトン対比などエネルギー代謝に関与するが、インスリンによるグリコーゲン合成には関与しないという明解な結論が得られた。この結果は、肝部分切除ラットモデルの結果とも一致し、ATPレベルの減少はNO増加によるミトコンドリア機能不全に由来すると考えられる。これらの結果は、iNOSによるNO産生の促進を抑制することが肝機能低下の防止に大きく貢献することを示唆している。

ii)　小腸株細胞におけるiNOSの誘導
　これまで、EGFが小腸移植の機能回復を促進することを報告してきたが、EGFの作用機序を明らかにするために、小腸株細胞でのiNOS誘導に及ぼす効果を検討した。初代培養肝細胞と異なり、小腸株細胞では、IL-1βでiNOSの誘導は起こらず、EGFを添加することではじめてiNOSが誘導され、継代を続けることにより、EGFの寄与が低下するという興味深い実験結果が得られた。　

３）　生殖器系における movo遺伝子のKOマウスの作製
　哺乳動物における生殖細胞の分化機構の分子レベルでの解析を目的として、ショウジョウバエで卵巣の分化および卵形成に関わるovo遺伝子のマウスホモログのクローニングを試み、マウス相同遺伝子であるmovo遺伝子の単離に成功した。構造解析の結果、movoの転写産物がZnフィンガーDNA結合モチーフを有する核タンパクであること、及びそのmRNAはマウスでは生後３週齢以降の精巣で特異的に発現していることを明らかにした。その後の解析によって、mOVO蛋白が実際にDNAの特定の塩基配列に結合しており、転写制御領域にその配列を含む遺伝子の転写活性をin vitroの培養系で変動させること、卵巣形成不能のovo^-/-ショウジョウバエにmovoを戻すと部分的に卵形成がみられることを明らかにした。movo遺伝子のKOマウスはlethalで胎盤形成に異常が認められた。転写因子としてmovoがどのように関与するのか、さらにconditional KOマウスの作製を行い、mOVO蛋白がどのように精子形成に関与するのか解明を進めている。

《研究業績》

学会誌等

Yasuda K, Okumura T, Okada H, Nakajima T, Aoki J, Arai H, Inoue K, Nishizawa M, Ito S and Kanzaki H(2001)
Platelet-activating factor acetylhydrolase isoformsⅠand Ⅱin human uterus. comparisons with pregnant uterus and myoma.
Biol Reprod 64:339-344

Kaibori M, Inoue T, Tu W, Oda M, Kwon A-H, Kamiyama Y and Okumura T(2001)
FK506, but not cyclosporin A, prevents mitochondrial dysfunction during hypoxia in rat hepatocytes
Life Sci 69:17-26

Minami T, Matsumura S, Okuda-Ashitaka E, Shimamoto K, Sakimura K, Mishina M, Mori, H and Ito S(2001)
Characterization of the glutamatergic system for induction and maintenance of allodynia.
Brain Res 895:178-185

Minami T, Bakoshi S, Nakano H, Mine O, Muratani T, Mori H and Ito S(2001)
The effects of capsaicin cream on prostaglandin-induced allodynia.
Anesth Analg 93:419-423

Minami T, Nakano H, Kobayashi T, Sugimoto Y, Ushikubi F, Ichikawa A, Narumiya S and Ito S(2001)
Characterization of EP receptor subtypes responsible for prostaglandin E2-induced pain responses by use of EP1 and EP3 receptor knockout mice.
Br J Pharmacol 133:438-444

Inoue M, Takahashi S, Yamashina I, Kaibori M, Okumura T, Kamiyama Y, Vichier-Guerre S, Cantacuzene D and Nakada H(2001)
High density O-glycosylation of the MUC2 tandem repeat unit by N-acetylgalactosaminyltransferase-3 in colonic adenocarcinoma extracts.
Cancer Res 61:950-956

Oyaizu H, Adachi Y, Okumura T, Okigaki M, Oyaizu N, Taketani S, Ikebukuro K, Fukuhara S and Ikehara S(2001)
Proteasome inhibitor 1 enhances paclitaxel-induced apoptosis in human lung adenocarcinoma cell line.
Oncol Rep 8:825-829

Maruyama R, Kawata A, Ono S, Nishizawa M, Ito S and Inoue M(2001)
Effects of amino acids on the amidation of polyaromatic carboxylic acids by Bacillus cereus.
Biosci Biotech Biochem 65:1761-1765

Maruyama R, Nishizawa M, Itoi Y, Ito S and Inoue M(2001)
Isolation and expression of a Bacillus cereus gene encoding benzil reductase.
Biotech Bioeng 75:630-633

Doi Y, Minami T, Nishizawa M, Mabuchi T, Mori H and Ito S(2001)
Central nociceptive role of prostacyclin (IP) receptor induced by peripheral inflammation.
Neuroreport 13:93-96

Kato Y, Hamada Y, Nakai K, Kitagawa K, Ito S, Okumura T and Hioki K(2002)
Effect of epidermal growth factor on intestinal adaptation after allogeneic small bowel transplantation in rats.
Life Sci 70: 809-819

Kaibori M, Inoue T, Oda M, Naka D, Kawaguchi T, Kitamura N, Miyazawa K, Kwon A-H, Kamiyama Y and Okumura T (2002)
Exogenously administered HGF-activator augments liver regeneration through the production of biologically active HGF.
Biochem Biophys Res Commun 290: 475-481

Maruyama R, Nishizawa M, Itoi Y, Ito S and Inoue M(2002)
The enzymes with benzil reductase activity conserved from bacteria to mammals.
J Biotechnol 94: 157-169

Okuda-Ashitaka E, Minami T and Ito S(2002)
Pain transmission regulated by novel neuropeptides nocistatin and nociceptin/orphanin FQ.
J Biol Macromol 2: 3-10

Tanikawa N, Ohmiya Y, Ohkubo H, Hashimoto K, Kangawa K, Kojima M, Ito S and Watanabe K(2002)
Identification and characterization of a novel type of membrane-associated prostaglandin E synthase.
Biochem Biophys Res Commun 291:884-889

Kitano M, Okumura T, Nishizawa M, Liew FY, Seki T, Inoue K and Ito S(2002)
Altered response to inflammatory cytokines in energy metabolism in inducible nitric oxide synthase knockout mice.
J Hepatol 36:759-765

総　　説

南　敏明、伊藤誠二（2001）
痛みの可塑性.
生物物理 41:15-19

海堀昌樹、井上知久、土屋英人、横井川規巨、權　雅憲、上山　泰男、奥村忠芳（2001）
肝臓の低酸素障害に対するFK506の保護効果.
今日の移植 14:61-66

Ito S, Okuda-Ashitaka E and Minami T (2001)
Central and peripheral roles of prostaglandins in pain and their interactions with novel neuropeptides nociceptin and nocistatin.
Neurosci Res 41: 299-332

伊藤誠二、松村伸治、南　敏明（2002）
生化学の立場からみた痛みの分子機構と治療
ペインクリニック 23: 363-368

学会発表

Ito S (2001)
Roles of prostaglandins in nociception.
7th International Congress on PAF and Lipid Mediators, Tokyo

Mine O, Matsumura S, Minami T, Sakai M, Okuda K, Takahashi H, Oka S, Kojima H, Nagano T, Fukasaku N, Mori H and Ito S (2001)
Production of nitric oxide by prostaglandin E2 in NG 108-15 cells.
The 31st Annual Meeting of Society for Neuroscience, San Diego, U.S.A.

Ito S, Yamada H, Nakano H, Kobayashi T, Sugimoto Y, ushikubi F, Ichikawa A, Narumiya S, Mori H and Minami T (2001)
Characterization of EP receptor subtypes responsible for prostaglandin E2-induced pain responses by EP1 and EP3 knockout mice.
The 31st Annual Meeting of Society for Neuroscience, San Diego, U.S.A.

Muratani T, Minami T, Nakano H, Okuda-Ashitaka E, Maekawa M, Mori H and Ito S (2001)
Effect of JTC-801, a novel nociceptin (Noc/OFQ) receptor antagonist, on pain responses in the formalin test.
The 31st Annual Meeting of Society for Neuroscience, San Diego, U.S.A.

Minami T, Matsumura S, Okuda-Ashitaka E, Shimamoto K, Imamura K, Mishina M, Mori H and Ito S (2001)
Characterization of the glutamatergic system for induction and maintenance of PG-induced allodynia.
The 31st Annual Meeting of Society for Neuroscience, San Diego, U.S.A.

Nakai K, Hamada Y, Kitagawa K, Kato Y and Okumura T (2001)
Effect of epidermal growth factor on the induction of dipeptide co-transporter after allogeneic small bowel transplantation.
VII International Small Bowel Transplantation Symposium, Stockholm, Sweden.

Kitagawa K, Hamada Y, Nakai K, Kato Y and Okumura T (2001)
Comparison of one- and two-step procedures in a rat model of small bowel transplantation.
VII International Small Bowel Transplantation Symposium, Stockholm, Sweden.

Tachibana S, Lee T-L, Ricos MG, Fung FMY, Zhang G, Chen F-G, Chou N, Okuda-Ashitaka E, Ito S, Nishiuchi Y and Kimura T (2001)
Comparison of nocistatin levels in CSF among chronic acute, non-pain patients and normal volunteers.
The 32nd International Narcotics Research Conference.

伊藤誠二、芦高恵美子 (2001)
ノシスタチンとノシセプチンによる痛覚調節機構
第５回神経伝達物質研究会、東京

Watanabe K, Yamamoto-Suzuki T, Nishizawa M, Tsutsui Y, Ishimura K and Ito S (2001)
Prostaglandin F synthase.
第74回日本生化学会、京都

海堀昌樹、井上知久、小田道夫、豊島茂、中西英樹、喜多村直実、宮澤恵二、權雅憲、上山泰男、奥村忠芳 (2001)
外因性HGF activatorによる70%肝部分切除ラットの肝内HGFの活性化
第74回日本生化学会、京都

Tu Wei、北出浩章、里井壮平、中西英樹、豊島茂、海堀昌樹、權雅憲、上山泰男、奥村忠芳 (2001)
閉鎖性黄疸による一酸化窒素の産生促進は肝機能障害に関与する
第74回日本生化学会、京都

伊藤誠二、松村伸治、芦高恵美子、島本啓子、三品昌美、南敏明 (2001)
脊髄の痛覚伝達におけるグルタミン酸の役割
第74回日本生化学会、京都

西澤幹雄、丸山励治、糸井泰、井上正美、伊藤誠二 (2001)
細菌から哺乳類まで保存されているベンジル還元酵素の解析
第74回日本生化学会、京都

馬渕圭生、江口直美、裏出良博、武藤誠、伊藤誠二 (2001)
神経因性疼痛におけるプロスタグランジンの関与
第74回日本生化学会、京都

伊藤誠二 (2001)
ノックアウトマウスを用いた痛覚反応の解析
「創薬薬理フォーラム」第２５回談話会, 東京

伊藤誠二 (2001)
神経因性疼痛の分子機構
第３５回日本ペインクリニック学会大会、岐阜

伊藤誠二 (2001)
脂質メディエーターと痛み受容
第２４回日本神経科学・第４４回日本神経化学　合同大会、京都

伊藤誠二 (2001)
ノックアウトマウスを用いた痛みの行動解析
遺伝子導入研究会、東京

伊藤誠二 (2001)
生物新機能と創薬をめざす生体内分子科学
学術創成第１回シンポジウム

中井宏治、濱田吉則、加藤泰規、北川克彦、伊藤誠二、奥村忠芳、日置紘士郎 (2001)
ラット異系小腸移植におけるepidermal growth factor (EGF) の糖およびジペプチド輸送坦体に関する検討
第16回静脈経腸学会、横浜

中井宏治、濱田吉則、加藤泰規、北川克彦、伊藤誠二、奥村忠芳、日置紘士郎 (2001)
ラット小腸移植におけるEGFが及ぼす移植腸管粘膜の糖消化吸収促進効果の検討
第101回日本外科学会、仙台

中井宏治、濱田吉則、加藤泰規、北川克彦、伊藤誠二、奥村忠芳、日置紘士郎 (2001)
ラット小腸移植におけるEGFの効果・二糖類分解酵素とNa⁺/グルコース輸送体
第38回小児外科学会、東京

海堀昌樹、井上知久、小田道夫、權雅憲、奥村忠芳、上山泰男 (2001)
肝臓の低酸素・再酸素化の胞障害に対するFK506の保護効果
第101回日本外科学会、仙台

海堀昌樹、豊島茂、中西英樹、宮澤恵二、喜多村直実、權雅憲、上山泰男、奥村忠芳 (2001)
外因性HGF活性化因子による肝部分切除ラットの肝再生の促進
第8回肝細胞研究会、東京

井上知久、中西英樹、豊島茂、海堀昌樹、西澤幹雄、伊藤誠二、奥村忠芳(2001)
低酸素における肝細胞の一酸化窒素合成酵素発現誘導の抑制とその機構
第48回日本生化学会近畿支部例会、奈良

中井宏治、濱田吉則、北川克彦、加藤泰規、馬殿徹也、福田秀明、伊藤誠二、奥村忠芳、日置紘士郎 (2001)
ラット小腸移植におけるEGFの効果・PepT1発現と二糖類分解酵素発現について
第４回近畿病態研究会、大阪

西澤幹雄、丸山励治、糸井泰、井上正美、伊藤誠二 (2001)
セレウス菌のベンジル還元酵素、酵母のYIR036C蛋白質とスナネズミのセピアプテリン還元酵素の比較
第２４回日本分子生物学会、横浜

芦高恵美子、南敏明、伊藤誠二 (2001)
痛みの分子機構
日本生物高分子学会2001年度大会、京都

著　　書

伊藤誠二、芦高恵美子、南　敏明（2001）
痛み研究の最前線　ノシセプチン関連　ノシスタチンの鎮痛作用オピオイド治療
課題と新潮流（ミクス）260-267頁.

伊藤誠二、芦高恵美子（2001）
ノシスタチンとノシセプチンによる痛覚調節機構神経ペプタイド　最新の話題　
第５回神経伝達物質研究会記録集（佐藤公道　編集）2-9頁,　エクセプタメディカ

南　敏明、森　秀麿、伊藤誠二（2001）
脊髄における痛みの伝達機構
臨麻　臨時増刊号299-310頁,（真興交易）

学会誌等

総 説

学会発表

著 書

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