現在進行中のテーマは以下の通りである。
１）HTLV-1 Tax遺伝子導入Ｔリンパ腫細胞のマウス個体内での動態解析
　Taxと蛍光蛋白GFPとの融合蛋白(Gax)を発現するEL-4マウスＴ細胞株(EL-4 Gax)を同系マウス腹腔内に移入すると、宿主免疫に依存して細胞レベルでのGax遺伝子の発現が抑制された。ところが、同細胞を個体内より回収し、試験管内での培養に移すと短時間で遺伝子発現の再開が観察され、個体内においてはGax遺伝子発現と宿主免疫とが動的な平衡関係にあることが強く示唆された。そこで、この遺伝子発現抑制の機構を明らかにする目的で、プロウイルスゲノムにおける転写調節領域のDNA CpGメチル化を解析したところ、遺伝子発現の再開にともなってメチル化の減少が示され、転写抑制がゲノムレベルで行われていることが明らかとなった。今後、抑制にかかわる免疫担当細胞あるいは液性因子の同定、および、細胞内シグナル伝達の関与に興味が持たれる。

２）HIV-1 Rev 蛋白発現によるインターフェロンmRNAの核外輸送阻害
　HIV-1 の構造蛋白 Gag, Env mRNA の核外輸送にかかわるRev蛋白の発現により、ルシフェラーゼ(Luc)発現ベクターからの遺伝子発現が抑制されたため、その機構を解析したところ、Luc-mRNAの核外輸送においても、Revを介したウイルスRNAの場合と同様、これまで細胞蛋白の核外輸送への関与が明らかとなっているCrm-1, Ranの利用が示された。Luc発現ベクターはイントロンを持たないことから、同じくイントロンを有しない細胞遺伝子としてインターフェロンの発現に対するRev蛋白発現の効果を解析したところ、RevによるインターフェロンmRNAの核外輸送抑制が観察された。この事実は、細胞mRNAの核外輸送においてもCrm-1, Ran等の蛋白核外輸送系が利用されている可能性と共に、HIV-1感染に対するインターフェロン作用の阻害を介した、個体レベルでのウイルス感染におけるRev遺伝子の新規の機能を強く示唆している。

３）分化特異的発現を示すレンチウイルスベクターの開発
　多くの遺伝性疾患の遺伝子治療においては、自己複製能をもつ幹細胞への遺伝子導入が重要であるが、幹細胞自身の複製効率はきわめて低いことから、ウイルスの宿主染色体への組込みに細胞分裂を必要としないレンチウイルスベクターが有効である。また、造血幹細胞は自己複製能に加え、すべての系統の血液細胞を産生する多分化能を併せ持つことから、標的遺伝子本来の発現様式を再現する必要がある。そこで、導入遺伝子の組織あるいは分化特異的な発現制御システムの構築を目的に、HIV-1を基にしたレンチウイルスベクターに、血小板系細胞特異的な発現を示すインテグリンGP2bプロモーターで制御されるGFP遺伝子を組み込み、VSV-G蛋白をエンベロープとするpseudovirusを作成した。このpseudovirusを、末梢血由来造血幹細胞およびインテグリンGP2bを発現するCMK細胞に感染させ、ゲノムに組み込まれた導入遺伝子の発現について解析したところ、インテグリンGP2bの細胞での発現に平行してGFPの発現が観察された。今後、感染効率の改良および他の血球系での特異的発現を試みる予定である。

４）Sam68遺伝子による細胞周期調節の解析
　細胞周期M 期特異的にチロシンリン酸化される蛋白として同定されていたRNA 結合蛋白Sam68 の遺伝子を欠損する細胞をトリDT40細胞株を用いて単離したところ、細胞周期のG2/M期の延長に起因する増殖遅延が観察された。そこで、Sam68遺伝子欠損細胞株において、G2/M期の進行に重要な役割を果たすことが明らかとなっているCdc2 kinaseの機能を解析した結果、ヒストンHI kinaseとしての活性には変化がなく、また、機能に関与する種々のリン酸化部位に関しても親株と差違が観察されず、G2/M期の延長が、cyclin/cdc2の活性の低下によるものではないことが明らかとなった。現在、これまでの解析でSam68蛋白との結合性が明らかとなっているβ-アクチンmRNAの安定性あるいは翻訳調節を中心に、細胞分裂や細胞運動の制御におけるSam68蛋白の機能に注目して研究を展開していく予定である。

原　　著

1. Furukawa T, Adachi Y, Fujisawa J-I, Kambe T, Yamaguchi-Iwai Y, Sasaki R, Kuwahara J, Ikehara S, Tokunaga R and Taketani S (2001)
   Involvement of PLAGL2 in activation of iron deficient- and hypoxia-induced gene expression in mouse cell lines.
   Oncogene 20:4718-4727
2. Takashima K, Miyake H, Furuta RA, Fujisawa J-I, Iizawa Y, Kanzaki N, Shiraishi M, Okonogi K and Baba M (2001)
   Inhibitory effects of small-molecule CCR5 antagonists on human immunodeficiency virus type 1 envelope-mediated membrane fusion and viral replication.
   Antimicrob Agents Chemother 45:3538-3543
3. Fukuda H, Motohiro T, Nakai K, Yamamichi K, Nakane Y, Fujisawa J and Hioki K (2001)
   Negative effect of transforming growth factor-beta-1 on intestinal anastomotic tissue regeneration.
   Eur Surg Res 33:388-394

学会発表

1. Li Q-H, Itoh M, Haga I and Fujisawa J-I (2001)
   Cell cycle retardation in G2/M-phase caused by gene disruption of Sam68 in chicken DT40 cells.
   第2回RNA結合蛋白国際会議, 米国

　

2. Inada T, Furuta RA and Fujisawa J-I (2001)
   Reversible and irreversible silencing of retrovectors in vivo. 　
   第7回日本遺伝子治療学会総会、東京
3. 伊藤道恭、芳賀　泉、李　慶華、藤澤順一 (2001)
   STAR蛋白質Sam68の標的RNA分子の解析　
   第3回日本RNA学会年会、神戸
4. 李　慶華、芳賀　泉、伊藤道恭、藤澤順一 (2001)
   RNA結合蛋白Sam68遺伝子欠失による細胞周期M期の伸長　
   第3回日本RNA学会年会、神戸
5. 稲田武文、川喜多繁誠、古田里佳、藤澤順一 (2001)
   個体内におけるHTLV-1遺伝子発現抑制機構の解析　
   第60回日本癌学会総会、横浜
6. 古田里佳、稲田武文、藤澤順一 (2001)
   個体内におけるHTLV-1遺伝子発現抑制機構の解析　
   第54回日本細菌学会関西支部総会、津
7. 木村富紀、西川正雄、橋本岩雄、藤澤順一 (2001)
   HIV-1 Rev蛋白依存的gag mRNA核外輸送系とイントロンレスmRNA格外輸送系との機能的相関
   第49回日本ウイルス学会学術集会・総会、大阪
8. 古田里佳、稲田武文、藤澤順一 (2001)
   HTLV-1持続感染に関与する遺伝子発現抑制機構
   第49回日本ウイルス学会学術集会・総会、大阪
9. 古田里佳、藤澤順一 (2001)
   試験管内変異導入法を用いたHIV-1侵入阻害剤耐性変異体の分離
   第15回日本エイズ学会学術集会・総会、シンポジウム　東京
10. 木村富紀、西川正雄、橋本岩雄、藤澤順一 (2001)
    HIV-1 Rev蛋白依存性ウイルスgag mRNA核外輸送系とイントロンレスmRNA核外輸送系との機能的相関　
    第15回日本エイズ学会学術集会・総会、東京
11. 木村富紀、西川正雄、橋本岩雄、藤澤順一 (2001)
    HIV-1 Rev蛋白依存性ウイルス mRNA核外輸送系とイントロンレスmRNA核外輸送系における細胞因子の共有　
    第24回日本分子生物学会年会、ワークショップ　横浜
12. 伊藤道恭、李　慶華、芳賀　泉、藤澤順一 (2001)
    STAR蛋白質Sam68の標的RNA分子の解析　
    第24回日本分子生物学会年会、横浜