生理学第一講座

《研究概要》

１）内向き整流Ｋチャネルの構造と機能
　　　ｉ）細胞内スペルミンによる外向き電流抑制
　本研究では、内向き整流Ｋチャネル遺伝子（IRK1；Kir2.1）の野生型(WT)、D172N変異体、およびこれらを直列に連結した四量体(WT-(D172N)2-WT)をCOS-1細胞に導入し、発現させたチャネルの外向き単一チャネル電流を記録し、細胞内スペルミンの抑制効果を検討している。今まで、ＷＴチャネルについては、脱分極パルス中の平均電流をもとめ、その減衰時間を計測していたが、今回、他のチャネルで行ったように、膜電位を＋42 mVに保持し、定常状態で外向き電流を記録した。開時間ヒストグラムは１つの指数関数でfitでき、平均開時間は、コントロール時53.1msであった。閉時間ヒストグラムのfittingには、２つの指数関数が必要で、時定数は、速いほうが、1.1ms−1.3ms、遅い方が130-345msであった。細胞内スペルミン存在下で、開時間は、37.8ms(1 nM)、11.7 ms(10 nM)に減少し、零電流時間は著明に延長した(10 nMで、5 s）。100　nMの場合、+42 mVでは、外向き電流は記録できなかった 。以上の結果から、コントロール時、１つの開状態（Ｏ）と２つの閉状態（Ｃ１、Ｃ２）があり、スペルミンによる 抑制状態(B)が加わると考えられる（Ｂ Ｏ Ｃ１ Ｃ２）。このモデルに基づき、各条件での平均開時間から 、ＯからＣ１への移行速度18.8ｓ−１、blocking rate 7.7s−１(1 nM)、 66.7s-1 (10 nM)をもとめた。100　nMでのblocking rate は、平均電流の減衰の時定数からもとめた（526.3s-1）.blocking rate は他の２つのチャネルでもとめた値に近かった。
　　ii) 内向き整流Kチャネル（IRK1）の神経細胞における機能・役割を解析する目的で，野生型IRK1遺伝子および translational enhancerとしてVEGFの 5’ 非翻訳領域の配列を持ち，かつN末端側にポリヒスチジンのタグが付いたIRK1遺伝子をそれぞれアデノウイルス・シャトルベクターに挿入した。その後 PI-SceI と I-CeuI で切り出し，その断片を試験管内で pAdeno-X ベクターとライゲーションを行い，recombinant adenovirus DNA を作成した。それぞれのrecombinant adenovirus DNA をHEK293 細胞へトランスフェクトし，ウイルス粒子の調製を行なった。得られたウイルス粒子の力価は野生型IRK1遺伝子で約5×105 pfu/mL，translational enhancerを持つIRK1遺伝子で約3×104 pfu/mLであった。各々をPC12細胞と初代ラット海馬神経細胞に種々のMOIで感染実験を行なった。しかし，ウイルス液の毒性が強く，また力価が高くないため，良好な発現が見られなかったので，ウイルス液の毒性除去と力価向上のためにウイルス粒子の精製を試みている。

　 ２）心筋遅延整流Kチャネルの構成様式とその機能の解析
　心筋の遅延整流KチャネルにはIksチャネルとIkrチャネルの2種があり，前者はKvLQT1が，後者はHERGがその主要構成蛋白質として機能し，それぞれの遺伝子の突然変異はlong QT syndrome (LQTS) を生ずる。我々は心筋細胞においてKCNE1がKvLQT1のみならずHERGともco-assembleすることを既に報告した。更に，KvLQT1遺伝子をHERGとco-assembleすると報告されているKCNE2の遺伝子と一緒にCOS細胞に導入すると，Iks電流が完全に抑制され，KCNE2 mutant (KCNE2/D82N) 遺伝子と一緒に導入した場合はKvLQT1遺伝子単独導入と同じチャネル特性となった。それぞれの遺伝子をCOS細胞に同時導入した時の各遺伝子産物の細胞内局在様式を蛍光抗体法を用いて検討を行なったところ，KvLQT1-KCNE2 複合体はER‐ゴルジ領域に蓄積し，KvLQT1-KCNE2/D82N複合体は細胞膜へ輸送されていることが明らかになった。

　３）ミクロソーム型アルデヒド脱水素酵素の小胞体局在化機構の解析
　 　ミクロソーム型アルデヒド脱水素酵素（msALDH）は、Ｃ末端アンカー型膜蛋白質の１つであり、Ｃ末端の疎水的領域で小胞体膜にアンカーしている。私達は、これまで、msALDHの小胞体局在化機構を解析し、そのＣ末端35アミノ酸残基内に小胞体局在化シグナルが存在することを明らかにした。MsALDHの小胞体局在化機構をさらに解析することを目的として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のＣ末端にmsALDHのＣ末端35アミノ酸を付加したキメラ蛋白質をCOS 細胞などに遺伝子導入し、その細胞内分布を高感度の免疫電顕法を用いて解析した。その結果、このキメラ蛋白質は小胞体膜と核膜に多数検出されたが、輸送小胞、ゴルジ体には検出されなかった。したがって、msALDHは、ゴルジ体からリトリーブされるKDELタンパク質などとは異なり、輸送小胞が小胞体から出芽する際に輸送小胞から排除され、小胞体に静的に残留すると考えられる。

　４）結晶体様小胞体の形成機構。我々は、培養細胞にＣ末端アンカー型膜蛋白質であるmsALDHを過剰発現させると結晶体様小胞体が形成されることを前の論文で報告した。今回、１型膜タンパク質であるシナプトタグミンの変異タンパク質の発現によっても結晶体様小胞体が形成されることを明らかにした。正常シナプトタグミン IVはゴルジ体に局在するが、そのＣ末端17アミノ酸を除去すると、ゴルジ体に局在しなくなり、顆粒状の結晶体様小胞体を形成する。Ｃ末端WHXLモチーフの除去によって、C2Bドメインの安定性が壊れ、誤って折り畳まれたタンパク質が小胞体に蓄積し、多量体を形成することによって結晶体様小胞体が形成されることが示唆された。この研究は、理研の副田光則博士との共同研究である。

　５）海馬における抑制系情報伝達修飾の解析。抑制性伝達と細胞内Ca2+濃度上昇について、海馬スライス標品を用い検討した。CA3領域の錐体細胞において、ブラジキニン、アセチルコリン、カフェインにより細胞内Ca2+ストアからの放出を促したところ、カフェイン刺激後にのみ、GABAA電流が減弱した。カフェインによる抑制はBAPTA非感受性で、Ca2+濃度上昇を介さないと考えられた。この事実から、GABAA電流の修飾にはCa2+ストアからの放出以外の経路によるCa2+動員、またはさらに高度のCa2+濃度上昇が必要であると推測される。脱分極後の電位依存性チャネルからのCa2+流入の影響、シナプス前繊維の刺激による伝達の修飾については、現在研究中である。

《研究業績》
原　　著
  1. Ohyama H, Kajita H, Omori K, Takumi T, Hiramoto N, Iwasaka T and Matsuda H (2001)
    Inhibition of cardiac delayed rectifier K+ currents by an antisense oligodeoxynucleotide against IsK (minK) and over-expression of IsK mutant D77N in neonatal mouse hearts.
    Pflugers Arch 442:329-335

  2. Shirasaki T, Houtani T, Sugimoto T and Matsuda H (2001)
    Spontaneous transient outward currents: modulation by nociceptin in murine dentate gyrus granule cells.
    Brain Res 917: 191-205

  3. Yamada H, Otuka M, Hayashi M, Nakatsuka S, Hamaguchi K, Yamamoto A and Moriyama Y (2001)
    Ca2+ - dependent exocytosis of L-glutamate by αTC6, clonal mouse pancreatic αcells.
    Diabetes 50:1012-1020

  4. Mizushima N, Yamamoto A, Hatano M, Kobayashi Y, Kabeya Y, Suzuki K, Tokuhisa T, Ohsumi Y and Yoshimori T (2001)
    Dissection of autophagosome formation using APG5-deficient mouse embryonic stem cells.
    J Cell Biol 152:657-668

  5. Hayashi M, Taniguchi S, Ishizuka Y, Kim H-S, Wataya Y, Yamamoto A and Moyiyama Y (2001)
    A homologue of N-ethylmaleimide-sensitive factor in the malaria parasite, plasmodium faciliparum, is exported and localized in vesticular structures in the cytoplasm of infected erythrocyte in the brefeldin A-sensitive pathway.
    J Biol Chem 276:15249-15255

  6. Miwako I, Yamamoto A, Kitamura T, Nahayama K and Ohashi M (2001)
    Cholesterol reguirement for insulin-like growth factor 2/cation-independent mannose 6-phosphate receptor transport from multivesicular late endosomes to the Golgi.
    J Cell Sci 114: 1765-1776

  7. Kim BY, Kramer H, Yamamoto A, Kominami E, Kohsaka S and Akazawa C (2001)
    Molecular characterization of mammalian homologues of Class C Vps proteins that interact with syntaxin 7.
    J Biol Chem 276:29393-29402

  8. Kiyozuka Y, Nakagawa H, Uemura Y, Senzaki H, Yamamoto A, Noguchi T, Mizuta H, Nakanishi K, Nakano S and Tsubura A (2001)
    Novel cell lines established from a human myxoid malignant fibrous histiocytoma arising in the uterus.
    Cancer Genet Cytogenet 127:7-15

  9. Yoshioka A Shirakawa R, Nishioka H, Tabuchi A, Higashi T, Harunobu Ozaki, Yamamoto A, Kita T and Horiuchi H (2001)
    Identification of protein kinase Ca as an essential, but not sufficient cytosolic factor for Ca2+-induced a- and dense-core granule secretion in platelets.
    J Biol Chem 276:43400-43406

  10. Oka T, Murata Y, Namba M, Yoshimizu T, Yamamoto A, Toyomura T, Sun-Wada G-H, Hamasaki N, Wada Y and Futai M (2001)
    a4, a unique kidney-specific isoform,of mouse vacuolar H+-ATPase subunit a.
    J Biol Chem 276:40050-40054

  11. Hayashi M, Otsuka M, Morimoto R, Hirota S, Yatsushiro S, Takeda J, Yamamoto A and Moriyama Y (2001)
    Differentiation-associated Na+-dependent inorganic phosphate cotransporter (DNPI) is a vesicular glutamate transporter in endocrine glutamatergic systems.
    J Biol Chem 276:43400-43406

  12. Fukuda M , Yamamoto A and Mikoshiba K (2001)
    Formation of crystalloid endoplasmic reticulum induced by expression of synaptotagmin lacking the conserved WHXL motif in the C-terminus: Structural importance of the WHXL motif in the C2B domain.
    J Biol Chem 276:41112-41119

  13. Sohda M, Misumi Y, Yamamoto A, Yano A, Nakamura N and Ikehara Y (2001)
    Identification and characterization of a novel Golgi protein, GCP60, that interacts with the integral membrane protein giantin.
    J Biol Chem 276: 45298-45306

  14. Kitagawa K, Yagyu K, Yamamoto A, Hattori N, Omori K, Zeng XT and Inagaki C (2001)
    Molecular cloning and characterization of the Cl- pump-associated 55-kDa protein in rat brain.
    Biochem Biophys Res Commun 289:363-371

  15. Nakamura N , Sun-Wada, G H, Yamamoto A, Wada Y and Futai M (2001)
    Association of mouse sorting nexin 1 with early endodomes.
    J Biochem 130:765-771

  16. Yoshioka A, Horiuchi H, Shirakawa R, Nishioka H, Tabuchi A, Higashi T, Yamamoto A and Kita T (2001)
    Molecular dissection of alpha- and dense-core granule secretion of platelets.
    Ann N Y Acad Sci 947:403-406

総　　説
  1. 山本章嗣、森山芳則 (2001)
    HOPS, SNARE, JAMP to FUSION; V-ATPaseが膜融合を引き起こす！？
    Chaperone Newsletter 9 (別冊): 14-17

  2. 田代裕、山本章嗣 (2001)
    タンパク質合成と輸送・オルガネラの機能-ゴルジ体の発見からシグナルペプチドまでー、
    遺伝 55: 63-73

  3. Higashida H, Yokoyama S, Hoshi N, Hashii M, Egorova A, Zhong Z.-G, Noda M, Shahidullah M, Taketo M, Knijnik R, Kimura Y, Takahashi H, Chen, X.-L., Shin, Y. and Zhang, J.-S. (2001)
    Signal transduction from bradykinin, angiotensin, adrenergic and muscarinic receptors to effector enzymes, including ADP-ribosyl cyclase.
    Biol Chem 382:23-30
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